Resistencia a biocidas en la práctica: mecanismos y relevancia

La limpieza y desinfección es la principal herramienta para el control de microorganismos indeseados en los entornos de trabajo. La eficacia de este proceso depende en gran medida del uso correcto de los detergentes y desinfectantes adecuados. En particular, los desinfectantes o biocidas están diseñados para eliminar una elevada carga microbiana en superficies, equipos y ambientes de producción.

No obstante, durante los últimos años ha aumentado la preocupación por la posible aparición de microorganismos resistentes a los biocidas. Esta inquietud surge principalmente de la experiencia acumulada con la resistencia a los antibióticos y de la hipótesis de que exposiciones repetidas a concentraciones subletales de desinfectantes puedan favorecer adaptaciones microbianas capaces de reducir su susceptibilidad.

¿Cuando se considera un microorganismo resistente?
Uno de los principales problemas en el estudio de la resistencia a biocidas radica en la falta de una definición universalmente aceptada. Dependiendo de la metodología utilizada, un microorganismo puede considerarse resistente cuando

a) presenta una disminución de la susceptibilidad a biocidas, determinada mediante valores de concentración mínima inhibitoria (MIC),

b) sobrevive a determinadas concentraciones de desinfectante, o

c) muestra diferencias significativas en parámetros como la concentración mínima biocida (MBC).

En el ámbito académico, la evaluación de la resistencia a biocidas suele basarse en la determinación de la MIC, por similitud con la evaluación de la resistencia a antibióticos. Aunque esta metodología permite estudiar tendencias en la susceptibilidad a biocidas, la extrapolación de los resultados al uso real de los desinfectantes presenta limitaciones. Esto se debe principalmente a que los desinfectantes se suelen emplear a concentraciones muy superiores a las necesarias para inhibir el crecimiento bacteriano.

Antibióticos y biocidas: diferencias fundamentales

Aunque los términos antibiótico y biocida o desinfectante se intercambian a menudo, existen grandes diferencias entre ambos tipos de productos.

Los antibióticos se aplican a seres vivos y actúan mediante mecanismos altamente específicos dirigidos contra estructuras o procesos metabólicos concretos del microorganismo diana. Además, los antibióticos se utilizan normalmente a concentraciones cercanas a la MIC y cuentan con el apoyo del sistema inmunitario del hospedador para completar la eliminación de la infección.

Los biocidas, por el contrario, se aplican también a elementos abióticos y, al contrario que los antibióticos, ejercen una acción menos específica, pudiendo interactuar simultáneamente con múltiples estructuras celulares. Los biocidas se aplican habitualmente a concentraciones varias veces superiores a la MIC, con el objetivo de conseguir elevadas reducciones de la población microbiana en una única intervención.

Tabla 1. Principales diferencias entre antibióticos y biocidas.

Estas diferencias explican por qué los mecanismos clásicos de resistencia observados frente a los antibióticos no siempre resultan extrapolables al caso de los biocidas.

Mecanismos de acción de los biocidas y de la resistencia a los mismos

Los biocidas pueden actuar sobre múltiples componentes celulares, tales como membranas citoplasmáticas, proteínas, enzimas, sistemas metabólicos o material genético. Debido a esta diversidad de dianas, la probabilidad de que una única mutación genética proporcione niveles elevados de resistencia suele ser relativamente baja.

Figura 1. Sustancias activas comunes en biocidas de uso industrial y sus dianas celulares [1].

Esta naturaleza multiobjetivo de la acción biocida constituye uno de los principales argumentos utilizados para explicar la escasa incidencia de resistencia significativa observada en condiciones reales de uso. A diferencia de muchos antibióticos, donde una mutación puntual puede inutilizar el mecanismo de acción del fármaco, los biocidas ejercen múltiples efectos simultáneos sobre la célula bacteriana.

Aún así, se han identificado distintos mecanismos de los que los microorganismos disponen para aumentar su tolerancia a biocidas. Entre ellos, se encuentran los siguientes [2]:

• Mecanismos que disminuyen la concentración de biocida dentro de la célula:
  • Limitación de la capacidad de penetración del biocida al interior de la célula. Por ejemplo, la membrana externa de las bacterias Gram negativas y la compleja envoltura celular de las micobacterias constituyen ejemplos clásicos de barreras naturales frente a numerosos compuestos antimicrobianos
  • Expulsión de biocidas mediante bombas de eflujo, proteínas transportadoras que expulsan sustancias tóxicas desde el interior celular hacia el exterior, reduciendo su acumulación intracelular.
  • Degradación de biocidas. Algunos microorganismos producen enzimas capaces de neutralizar compuestos antimicrobianos. La catalasa, por ejemplo, puede contribuir a la detoxificación de agentes oxidantes mediante la degradación del peróxido de hidrógeno.
• Cambios fisiológicos y metabólicos. Por ejemplo, producción de piruvato y ácidos grasos en Salmonella enterica expuesta a triclosán.
• Mutaciones inducidas por presión selectiva. La exposición continuada a concentraciones subletales puede favorecer la selección de variantes con mutaciones que mejoran su capacidad de supervivencia frente a determinados compuestos biocidas.

Estos mecanismos pueden activarse a raíz de la exposición de microorganismos a concentraciones subletales de biocida. Esta exposición genera estrés celular incluso cuando las concentraciones utilizadas son relativamente bajas, lo que desencadena respuestas regulatorias destinadas a minimizar el daño y favorecer la supervivencia. Como consecuencia, se producen cambios en la expresión génica, especialmente en genes implicados en procesos reguladores del metabolismo general, reparación celular y mecanismos de protección frente al estrés.

Este fenómeno ha sido descrito en diversos microorganismos. Entre los ejemplos citados en la literatura se incluyen respuestas frente a biguanidas en Escherichia coli, frente a agentes oxidantes en Bacillus subtilis y frente a radiaciones ionizantes o ultravioleta en Deinococcus radiodurans.

La resistencia a biocidas puede ser intrínseca o adquirida. La resistencia intrínseca constituye una propiedad natural de determinados microorganismos, relacionada con características estructurales o fisiológicas propias de la especie. Por el contrario, la resistencia adquirida aparece como consecuencia de mutaciones o de la incorporación de genes procedentes de otros microorganismos mediante transferencia genética horizontal.

Relevancia práctica de la resistencia a biocidas

Una de las grandes preocupaciones en higiene es la posibilidad de que la exposición continuada a dosis subletales de biocidas genere el desarrollo de resistencias en los microorganismos y que esto conduzca a la aparición de resistencias a antibióticos, lo que puede generar un gran problema en el ámbito sanitario. Las respuestas generales de los microorganismos al estrés pueden inducir mecanismos inespecíficos que aumenten su tolerancia al biocida, como la sobreexpresión de bombas de eflujo, modificaciones en la permeabilidad celular o cambios metabólicos. Estos mecanismos inespecíficos podrían también influir en la susceptibilidad del microorganismo frente a determinados antibióticos.

Sin embargo, la evidencia científica disponible resulta contradictoria. Algunos estudios encuentran asociaciones entre ambos fenómenos, mientras que otros no detectan relaciones significativas. Por ello, actualmente no existe consenso sobre el verdadero impacto de los biocidas en la selección de resistencia antibiótica en condiciones reales de uso.

Asimismo, la evidencia acumulada hasta el momento sugiere que la aparición de resistencia a biocidas es posible, aunque presenta una baja probabilidad debido a dos factores fundamentales: la existencia de múltiples dianas celulares y el empleo habitual de concentraciones muy superiores a la MIC, que minimizan la posibilidad de supervivencia de los microorganismos. Además, gran parte de los estudios que apoyan una relación causal entre la resistencia a biocidas y a antibióticos se han realizado utilizando cepas adaptadas experimentalmente mediante exposiciones repetidas a dosis subletales. Esta situación es poco representativa de las condiciones de aplicación recomendadas en la práctica industrial, ya que, si se aplican los protocolos de limpieza y desinfección correctamente, la dosis de biocida aplicada debe ser capaz de inactivar la carga microbiana presente, sin posibilidad de dar lugar al desarrollo de resistencias. Finalmente, la literatura muestra resultados variables. En algunos casos se observa aumento de la tolerancia; en otros, disminución. Del mismo modo, las adaptaciones pueden ser transitorias o permanentes, lo que dificulta establecer conclusiones definitivas [3].

En los casos en los que se ha reportado un aumento de la tolerancia a biocidas tras la exposición repetida a concentraciones subletales, este aumento de la tolerancia se refleja en valores de MIC hasta 10 veces superiores a los de las cepas que no han desarrollado tolerancia (Figura 2). Aún así, este hecho tiene poca relevancia en la práctica, ya que las concentraciones de uso de los biocidas suelen ser, al menos, 100 veces superiores a la MIC.

Figura 2. Valores de MIC para aislados de bacterias Gram-positivas procedentes de la industria láctea. Los valores en la tabla muestran el número de aislados susceptibles a una determinada concentración de biocida antes (Tabla 1) y después (Tabla 2) de la exposición repetida a concentraciones subletales de dichos biocidas.[4].

Persistencia microbiana: impacto y causas

Aunque la resistencia a biocidas suele recibir una gran atención, la persistencia de microorganismos en instalaciones industriales constituye probablemente un desafío más importante. Se consideran persistentes aquellas cepas que son aisladas repetidamente en una misma instalación durante meses o incluso años.

La persistencia no implica necesariamente mayor resistencia a los desinfectantes. De hecho, estudios realizados con Listeria monocytogenes han demostrado que cepas persistentes pueden presentar una capacidad superior para formar biofilms sin mostrar una resistencia significativamente mayor frente a los desinfectantes [5].

La supervivencia de microorganismos después de las operaciones de limpieza y desinfección podría por tanto deberse a que estos microorganismos son significativamente más resistentes a los biocidas empleados. Sin embargo, en la práctica, esta causa es poco probable, por los motivos explicados anteriormente. Es más habitual que los microorganismos sobrevivan simplemente porque han estado expuestos a concentraciones no letales del biocida. Esto puede deberse a causas operativas o de las propias instalaciones de producción. Algunos ejemplos de estas posibles causas son:

• Errores de aplicación (dosificación, presión)
• Tiempo de contacto inadecuado
• Presencia de interferentes (residuos, detergente)
• Puntos inaccesibles para la limpieza
• Formación de biofilms, que protegen a los microorganismos de la acción del biocida.

La secuencia típica que explica la aparición de contaminación persistente comienza generalmente con una limpieza insuficiente que deja residuos orgánicos capaces de inactivar parcialmente el desinfectante. Esto favorece la supervivencia de microorganismos, el desarrollo de biofilms, la aparición de cepas persistentes y la posterior recontaminación de superficies y alimentos.

Conclusiones

El desarrollo de resistencias a biocidas en microorganismos es un fenómeno biológicamente posible, pero la evidencia disponible indica que su relevancia práctica en higiene industrial es limitada cuando se utilizan los productos adecuados y se aplican correctamente y a las concentraciones recomendadas.

Por el contrario, la persistencia microbiana y la formación de biofilms constituyen desafíos mucho más frecuentes en los programas de higiene industrial. La supervivencia de microorganismos tras la desinfección suele estar relacionada con prácticas de limpieza deficientes, deficiencias operacionales o protección física dentro de biofilms más que con verdaderos procesos de resistencia.

En consecuencia, las estrategias de control deben centrarse en la validación de los procedimientos de limpieza y desinfección, la eliminación de nichos de contaminación, el monitoreo microbiológico y la evaluación integral de la higiene. Solo mediante un enfoque preventivo y sistemático es posible minimizar el riesgo de persistencia y garantizar la seguridad microbiológica de los procesos industriales.

Bibliografía

[1] Fanning S. 2011. Altered tolerance to biocides: links to antibiotic resistance? IAFP European Symposium on Food Safety, The Netherlands

[2] Maillard J-Y. 2018. Resistance of bacteria to biocides. Microbiol Spectrum 6(2):ARBA-0006-2017

[3] Donaghy J A et al. 2019. Relationship of Sanitizers, Disinfectants, and Cleaning Agents with Antimicrobial Resistance. Journal of Food Protection 82(5):889-902

[4] Fernández Márquez M.L. et al. 2017. Characterization of biocide-tolerant bacteria isolated from cheese and dairy small-medium enterprises. Food Microbiology, 62:77-81

[5] Rodríguez-Campos D.et al. 2019. Persistent Listeria monocytogenes Isolates from a Poultry-Processing Facility Form More Biofilms but Do Not Have a Greater Resistance to Disinfectants than Sporadic Strains. Pathogens 8:250