Biofilmes: componentes e funções da matriz

Os biofilmes são uma das maiores preocupações em termos de higiene na indústria alimentar. Os biofilmes são grupos de microrganismos que se acumulam numa interface sólido-líquido e estão rodeados por uma matriz mucilaginosa[1]. A matriz do biofilme é o material extracelular, produzido principalmente pelos próprios microrganismos, no qual as células dos biofilmes são incorporadas. É integrado por um conglomerado de diferentes tipos de biopolímeros, conhecidos como Extracellular Polymer Substances (EPS), atuando como suporte da estrutura tridimensional do biofilme. A formação do biofilme dá às células um modo de vida completamente diferente do estado planctónico, protegendo-as de ambientes adversos e facilitando a sua sobrevivência.

A formação do biofilme em superfícies segue um processo sequencial representado na Figura 1, e começa com a adesão das células à superfície. Isto resulta na formação de microcolónias e induz as células agrupadas a sofrerem alterações fenotípicas utilizadas para se adaptarem ao novo ambiente. Começam a produzir EPS para gerar a matriz do biofilme e fazer crescer o biofilme. O biofilme maduro tem uma estrutura que se estende perpendicularmente à superfície, muitas vezes em forma de cogumelo, com canais através dos quais a água pode circular.

Figura 1. Fases de desenvolvimento de um biofilme numa superfície.

A matriz do biofilme retém as células e mantém-nas próximas umas das outras, permitindo um elevado grau de interação que inclui a comunicação intercelular e a formação de microconversões sinérgicas. Além disso, a matriz protege os organismos contra a secagem, oxidantes, biocidas, alguns antibióticos e catiões metálicos, radiação ultravioleta e defesas imunitárias. No entanto, as células do biofilme não estão completamente imobilizadas, podem mover-se dentro do biofilme e desprender-se do mesmo.

Existe uma grande variedade de EPS que podem formar a matriz do biofilme, dependendo dos microrganismos presentes, das forças de cisalhamento experimentadas durante a sua formação, da temperatura e da disponibilidade de nutrientes. Em geral, os principais componentes da matriz do biofilme são água, polissacáridos, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos e outros biopolímeros. A figura 2 representa de forma simplificada os diferentes EPS que podem ser encontrados na matriz do biofilme e a forma como estão distribuídos entre as suas células.

Figura 2. Representação da distribuição dos principais componentes da matriz do biofilme (polissacáridos, proteínas e ADN) entre as células que habitam o biofilme[2].

A estrutura do biofilme é influenciada pelo EPS incluído na sua matriz, bem como por muitos outros fatores, tais como condições hidrodinâmicas, concentração de nutrientes, mobilidade bacteriana e comunicação intercelular e iões metálicos que possam existir no ambiente.

Alguns dos componentes principais da matriz do biofilme são descritos abaixo:

 

Exopolissacáridos

Os polissacáridos são uma fração predominante da matriz extracelular, e aparecem omnipresentes em biofilmes formados em diferentes ambientes: água salgada, água doce, solos, infeções em humanos, culturas laboratoriais, etc. A maioria deles são moléculas longas, lineares ou ramificadas, com massa molecular de aproximadamente 106 D[3] e consistem numa mistura de açúcares neutros e carregados, pelo que são heteropolissacáridos. Podem também conter substitutos orgânicos ou inorgânicos que afetam significativamente as suas propriedades físicas e biológicas. Por exemplo, um dos exopolissacáridos mais comuns é o alginato, constituído por ácidos D-manúrico e L-gulurónico e produzido em biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, um dos modelos de biofilme mais estudados [4].

Os exopolissacáridos desempenham vários papéis essenciais na formação do biofilme, geralmente associados à sua aderência às superfícies e à manutenção da integridade estrutural. A sua natureza química pode variar dependendo dos microorganismos que os produzem, embora os exopolissacáridos encontrados na matriz do biofilme não reflitam necessariamente a distribuição microbiana do biofilme, devido ao facto de as células incapazes de produzir exopolissacáridos poderem ser alojadas em biofilmes de espécies mistas[5].

Proteínas extracelulares

As proteínas presentes na matriz extracelular têm funções que permitem o crescimento do biofilme e a sobrevivência das células alojadas, facilitando o acesso aos nutrientes ou a regulação da integridade e a estabilidade do biofilme.

A matriz do biofilme contém várias enzimas extracelulares, geralmente associadas a exopolissacáridos, muitas das quais estão envolvidas na degradação do biopolímero. A presença de enzimas que degradam componentes de matriz extracelular converte esta matriz num sistema digestivo externo que degrada os biopolímeros em produtos de baixa massa molecular que podem ser assimilados e utilizados como fontes de energia e carbono. Por exemplo, a degradação dos exopolissacáridos deve-se principalmente às hidrolases e às liasases. Estas enzimas podem atuar sobre o EPS produzido pelas mesmas bactérias que produzem a enzima ou sobre o EPS de outras espécies. Do mesmo modo, a degradação estrutural do EPS desempenha um papel importante no desenvolvimento do biofilme, uma vez que permite a dispersão das células sésseis dos biofilmes, permitindo a formação de novos biofilmes. Esta dispersão ocorre em resposta a alterações ambientais, tais como escassez de nutrientes ou súbita disponibilidade de nutrientes.

Além disso, outras enzimas podem mesmo degradar as superfícies que alojam o biofilme, como é o caso das enzimas redox que contribuem para a corrosão microbiana [6].

As proteínas não enzimáticas da matriz, tais como as associadas às paredes celulares ou leptinas (proteínas de ligação aos hidratos de carbono), estão envolvidas na formação e estabilização da rede de polissacáridos da matriz e são uma ligação entre a superfície bacteriana e o EPS extracelular. Estas proteínas fomentam a formação de biofilme em várias espécies bacterianas e desempenham papéis como a adesão a superfícies inanimadas e células hospedeiras [7].

Finalmente, os apêndices proteicos, tais como pili, fimbriae e flagella, podem também atuar como elementos estruturais através da sua interação com outros EPS da matriz do biofilme.

ADN extracelular

O ADN extracelular (eDNA) é parte integrante da matriz do biofilme e do seu modo de vida[8]. Por exemplo, foi demonstrado que o eDNA é um componente importante na matriz dos biofilmes de P. aeruginosa, onde atua como um conector intercelular, e de facto a presença de DNAase inibe a formação destes biofilmes[9]. Nos biofilmes de outras espécies, o eDNA atua como um adesivo ou mesmo como um agente antimicrobiano, causando lise celular por catiões quelantes que estabilizam os lipopolissacáridos e a membrana externa bacteriana.

Surfactantes e lípidos

Ao contrário dos polissacáridos, proteínas e ADN, que são moléculas hidrofílicas, outros EPS com propriedades hidrofóbicas estão presentes na matriz do biofilme. Este carácter hidrofóbico tem sido associado a substituintes metil e acetil em polissacáridos ou lípidos, essenciais para a adesão de bactérias a superfícies hidrofóbicas.

Além disso, outros EPS com capacidade surfactante, tais como surfactina, viscosina e emulsionante, podem dispersar substâncias hidrofóbicas e facilitar a sua disponibilidade. Os biosurfactantes foram identificados como fatores que promovem a formação inicial de microcolónias, favorecendo a migração de bactérias associadas à superfície e a formação de estruturas em forma de cogumelo, impedindo a colonização de canais e contribuindo para a dispersão do biofilme.

Água

O principal componente da matriz do biofilme é a água. A matriz de exopolímero proporciona um ambiente altamente hidratado que perde água mais lentamente do que o seu ambiente circundante, protegendo assim as células do biofilme contra as flutuações do potencial hídrico. As bactérias respondem ativamente à secagem através da produção de EPS[10]. Além disso, a matriz de exopolímero pode atuar como um filtro molecular, retendo catiões, aniões, componentes não polares e partículas na fase aquosa. O EPS contém regiões não-polares, grupos com potencial para formar ligações de hidrogénio, grupos aniónicos (em ácidos urónicos e proteínas) e grupos catiónicos (em aminoácidos).

O EPS e as propriedades mecânicas

Em geral, os biofilmes mostram propriedades viscoelásticas. Podem experimentar tanto respostas elásticas reversíveis como deformações irreversíveis, dependendo das forças que atuam sobre a matriz do exopolímero. Este facto sugere que existem pontos de ligação flutuantes entre componentes EPS que permanecem ligados por fracas interacções físico-químicas, tais como ligações de hidrogénio, forças van der Waals e interacções electrostáticas (ver Figura 2). A ligação cruzada dos biopolímeros contribui para a estabilidade da matriz[11]. Do mesmo modo, a interação de iões inorgânicos multivalentes com EPS pode influenciar significativamente as propriedades mecânicas dos biofilmes. Por exemplo, a presença de Ca2+ aumenta a estabilidade mecânica dos biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, devido à ligação cruzada com moléculas de alginato polianiónico[9].

Em conclusão, a matriz do biofilme bacteriano é um ambiente extremamente complexo que permite às células alojadas um modo de vida completamente diferente do estado plâncton. As substâncias exopoliméricas (EPS) são essenciais para a formação do biofilme e a sua variedade fornece várias funções que permitem a expansão e sobrevivência das células no biofilme contra agressões externas. A complexidade da matriz do biofilme e o nível de proteção que esta forma de vida proporciona aos microrganismos significam que a sua formação representa um risco significativo para a segurança alimentar e que o controlo dos biofilmes requer a aplicação de procedimentos de higiene específicos e a utilização de ferramentas especializadas.

A Christeyns é especialista em higiene e limpeza na Indústria Alimentar e pode ajudá-lo na deteção e  eliminação de biofilmes. Contacte-nos para saber mais sobre este assunto aqui.

Bibliografia

[1] Chmielewski R.A.N., Frank J.F. (2003) Biofilm formation and control in food processing facilities. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2, 22-32.

[2] Flemming H.C., Wingender J. (2010) The biofilm matrix. Nature Reviews 8, 623-633.

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[5] Sillman L., Sutherland I.W., Jonse M.V. (1999) The role of exopolysaccharides in dual species biofilm development. Journal of Applied Microbiology 85, S13-S18.

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[7] Lasa I., Penadés J.R. (2006) Bap: a family of surface proteins involved in biofilm formation. Research in Microbiology 157, 99-107.

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[11] Körstgens V., Flemming H.C., Wingender J., Borchard W. (2001) Influence of calcium ions on the mechanical properties of a model biofilm of mucoid Pseudomonas aeruginosaWater Science and Technology 43, 49-57.

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