Bioluminiscencia para el control de la higiene en industrias alimentarias

Debido a las crisis alimentarias acaecidas durante finales del siglo XX y comienzos del actual,  se produjo un incremento de la concienciación de los consumidores respecto a  la seguridad de los alimentos. A su vez, las autoridades, tanto nacionales como comunitarias, reflejaron esta preocupación en una nueva normativa alimentaria, conocida como «paquete de higiene», que se articuló en seis Reglamentos, en los que se armonizaron y simplificaron diecisiete Directivas, y dio lugar a una política de higiene alimentaria única y transparente, que es aplicable a todos los alimentos desde el 1 de enero de 2006.

Los Reglamentos que conforman el paquete de higiene son: Reglamento (CE) 178/2002, Reglamento (CE) 852/2004, Reglamento (CE) 853/2004, Reglamento (CE) 854/2004, Reglamento (CE) 882/2004, Reglamento (CE) 183/2005. De entre ellos, el Reglamento (CE) nº 852/2004 relativo a la higiene de los productos alimenticios, definió una serie de objetivos de seguridad alimentaria que deben cumplir las empresas alimentarias, donde se pone un mayor énfasis en la prevención, y que también promueve el autocontrol por parte de las industrias. Al mismo tiempo, las cadenas de distribución, se hicieron eco de esta preocupación y, como clientes de los fabricantes, y proveedores del consumidor final, han establecido sistemas de control de sus proveedores basados en los principios que rigen la normativa comunitaria. Por todo ello, las empresas del sector alimentario comenzaron a aplicar los principios del sistema de análisis de riesgos y control de los puntos críticos (APPCC) establecidos en el Codex Alimentarius.

Como parte de los pre-requisitos, previos a la implantación del sistema APPCC, juega un papel de gran importancia el mantenimiento en correctas condiciones higiénicas de todas las zonas de elaboración y almacenamiento de alimentos. Por ello, adquieren especial relevancia los protocolos de Limpieza y Desinfección de las instalaciones, y con ellos la verificación de que estos se están cumpliendo conforme a lo establecido.

Esta verificación de la idoneidad de los procesos de L+D se puede realizar de distintos modos. Por medio de análisis de superficies mediante placas de contacto, con medios selectivos, puede conocerse la bondad del proceso de limpieza y desinfección. Estos sistemas de verificación basados en la microbiología son de gran utilidad, y se han establecido especificaciones para delimitar los niveles microbiológicos correctos (Orihuel et al, 1998).

Para cumplir con los límites microbiológicos establecidos en estas especificaciones es importante que los procesos que forman parte de la higienización: Limpieza y Desinfección, se realicen correctamente. Las prácticas inadecuadas en alguno de ellos darán lugar a niveles microbiológicos elevados en la instalación, y la posibilidad de que se produzcan contaminaciones cruzadas a los productos elaborados. Ya se ha señalado anteriormente cómo podemos conocer la presencia de microorganismos en superficies mediante las placas de contacto, es una técnica que consigue resultados repetitivos y fiables, y que por tanto nos indica muy certeramente la bondad de los procesos. Sin embargo, para que los resultados microbiológicos sean correctos, además de realizar una correcta desinfección de las superficies, es importante que estas se hayan limpiado a fondo, y que no queden restos orgánicos que puedan interferir la acción biocida de los desinfectantes. La verificación de la fase de limpieza es un aspecto que usualmente se ha realizado mediante inspecciones visuales de los elementos de la instalación, estableciendo una escala valorativa, en función de los restos orgánicos que puedan quedar. Sin embargo, esta valoración no está exenta de subjetividad, y en muchos casos los resultados pueden variar en función de la persona que realice la inspección, y en todo caso siempre estarán sujetos a discusión.

Para evitar este problema, y objetivar las inspecciones de la limpieza, se puede utilizar el método de la bioluminiscencia. Con esta técnica se muestrea una parte de la instalación con un hisopo y se determina por bioluminiscencia su contenido en ATP (Adenosin trifosfato). El ATP es el compuesto que almacena la energía en todas las células vivas. Está presente en los alimentos tanto como ATP de origen orgánico, como parte de las carnes, pescado, vegetales, etc., o como ATP de procedencia microbiana.

El complejo enzimático luciferin-luciferasa convierte la energía química del ATP (microbiano y no microbiano) en luz a través de una reacción de óxido-reducción. La reacción bioluminiscente catalizada por la luciferasa utiliza la energía química contenida en la molécula de ATP para producir la descarboxilización oxidativa de la luciferina a oxiluciferina, dando como resultado la producción de luz. La cantidad de luz emitida es proporcional a los niveles de microorganismos y/o materia orgánica presente en la muestra que se pretende evaluar. La luz emitida es posteriormente cuantificada usando un equipo denominado luminómetro, que expresa el resultado medido en unidades relativas de luz (URL).

La cantidad de ATP recuperado en el hisopo depende de la contaminación microbiana y de la presencia de residuos orgánicos. Estos valores varían según el tipo de materia (superficie), el tipo de proceso, el tipo de células predominantes, el grado de procesamiento de la materia prima, etc. Por lo tanto, resulta importante establecer los umbrales de aceptación de acuerdo con cada caso en particular.

La medida del ATP permite, pues, indicar en tiempo real si la limpieza de las superficies se ha realizado correctamente, y además pueden corregirse situaciones incorrectas antes de la siguiente jornada de trabajo (Osimani et al, 2014).

Sin embargo, como se ha indicado, para poder trabajar con esta técnica, es importante, al igual que se ha realizado con las técnicas de análisis microbiológico de de superficies, establecer criterios objetivos (límites críticos o especificaciones) que indiquen qué niveles pueden considerarse correctos. Por ellos se realizó una  experiencia encaminada a establecer límites críticos o especificaciones que permitan afirmar, mediante la técnica de bioluminiscencia, cuando se han realizado correctamente las operaciones de Limpieza.

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Experiencia para determinar límites críticos de higiene meidante la técnica de bioluminiscencia

Material y métodos

Los ensayos se efectuaron en distintas plantas de procesado de alimentos, en concreto, industrias cárnicas e industrias de pescado. Aún siendo distinta la suciedad inicial presente en las instalaciones, dado que lo que se pretende es conseguir alcanzar el máximo nivel de higiene, los resultados se han tratado conjuntamente.

Para la realización de las medidas de ATP se utilizó el Luminómetro 3M™ Clean‑Trace™ NGi, que es un luminómetro que se emplea junto con los kits reactivos de 3M para medir los niveles de ATP en las superficies. La recogida de muestras se realiza con un hisopo que contiene el reactivo. La torunda se frota contra la superficie a muestrear, aplicando presión. Se va girando la torunda para utilizar toda la superficie mientras se toma la muestra. Se aplica a una superficie de 10 x 10 cm., en horizontal, de un lado a otro, y después en vertical.

Previamente, para cada planta donde se efectuaron los ensayos, se había confeccionado un protocolo de L+D. La toma de muestras e inoculaciones se  realizaron  durante y después de finalizada  la  jornada  habitual  de trabajo, y tras la realización de las prácticas de limpieza y desinfección. Estas prácticas incluían las siguientes fases:

1. Enjuague de la instalación con agua, para eliminar los residuos más groseros.
2. Fregado con agua caliente y el producto desengrasante alcalino BETELENE FORTE a la dosis del 2 %.

• Enjuague con agua para eliminar los restos de suciedad y del desengrasante.

1. Desinfección con el producto desinfectante  QUACIDE MC7 (12,5  % m.c.a.) aplicado con un satélite de aplicación, a la dosis del 2 %.
2. Enjuague con agua de todas las superficies que vayan a entrar en contacto con los Este enjuague se realizó un mínimo de 15 minutos después  de  la aplicación del producto desinfectante.

Se determinó la eficacia de las prácticas de limpieza y desinfección descritas mediante análisis microbiológicos previos, interpretados de acuerdo con la bibliografía y las especificaciones establecidas por el Departamento Técnico de Betelgeux, S.L. Aunque ya se ha indicado que, en las medidas de bioluminiscencia se incluyen tanto el ATP microbiano, como el perteneciente a restos orgánicos, y por tanto un valor elevado puede indicar presencia de suciedad orgánica, pero es posible que no haya elevada presencia de microorganismos, debido a la acción de los productos biocidas aplicados; se considera que si se alcanzan niveles microbiológicos correctos, según las especificaciones, es porque el nivel de limpieza es correcto.

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Resultados

En  la  Tabla  1  se recogen los resultados obtenidos  en  las  ocho  series  de análisis  de bioluminiscencia realizadas. Se han calculado las medias aritméticas de  cada  uno de  estos análisis, así como la media global de todos los puntos inoculados. Estos  resultados  se  han representado gráficamente en forma de histograma de  frecuencias  en  la Figura 2. Se observa en ambos histogramas una homogeneidad muy elevada.

No obstante la homogeneidad alcanzada en las ocho series, en anteriores  estudios experimentales se ha observado que al emplear la técnica de bioluminiscencia en  instalaciones  de  industrias  y establecimientos alimentarios,  es  muy  frecuente  el obtener  dentro de un análisis algún valor que se aleja extraordinariamente de  la  media aritmética.  Así  ocurre  por ejemplo con el valor (2,j) de la Tabla 1.  Cuando  se trabaja  con  un  número reducido de muestras (10-20),  este  hecho  puede conducir  a  conclusiones  erróneas  a la hora de  interpretar  los  valores  promedio  del análisis.  Por ello parece razonable la exclusión en cada serie de análisis del  valor  más alejado de la media aritmética, y recalcular la media aritmética excluyendo dicho valor. Esta media aritmética corregida se simboliza como x*.

En  la Tabla 2 se expresan los valores de x* de todas las series de análisis  realizados, y en la Tabla 1 se señalan en negrita los resultados excluidos para el cálculo de x* en cada una de estas series de análisis.

Se  parte  ahora  de la hipótesis de que las prácticas  de  limpieza  y  desinfección realizadas  previamente  a las series de análisis son efectivas y se han  realizado  correctamente (esta hipótesis se sustenta en el hecho de que los resultados obtenidos son  inferiores a los que se recomiendan en la bibliografía para determinación de ATP en superficies (Larson et al, 2003). Es decir, se supone que el nivel de  contaminación  microbiológica  superficial  encontrado después de las prácticas  de  limpieza  y desinfección,  es  un  nivel adecuado para el fin que se  persigue  con  dichas  prácticas. Asumida  esta  hipótesis y obtenidas las medias corregidas de cada serie, x*_i (i = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8), se establece el valor límite que se utilizará en la  especificación.  Este valor límite (VL) se utilizará como criterio para  determinar  si las  operaciones  de  limpieza  se han  realizado  correctamente.  Para  el cálculo de este valor se ha operado del siguiente modo:

1. a) Se ha calculado la media aritmética de los seis valores de x*_i:

1. b) Se calcula el intervalo de confianza de X^*, para un valor de la probabilidad  del  99 %. El valor límite (VL) será:

siendo:

                         t = valor de la distribución x de Student para 7 grados de libertad (n-1) y una probabilidad p = 0,99.

                         s = desviación típica del conjunto de las 8 medias corregidas x*_i.

                         n = 8 = número de las series de análisis realizadas.

Operando  de este modo se obtienen los valores de VL para la bioluminiscencia:

                    Bioluminiscencia: VL_LRUc = 113,78 + 72,087 = 185,86 ≈ 186

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Con  estos valores se establece el criterio interpretativo siguiente, que se  resume en la Tabla 3:

• CORRECTO: valores de x* inferiores a VL; las prácticas de limpieza se  han realizado correctamente.
• INCORRECTO: valores de x* superiores a (VL + s); las prácticas de limpieza y desinfección se han realizado de modo incorrecto.
• Para valores de x* comprendidos entre VL y (VL +s) se interpreta que las prácticas de limpieza  y desinfección no son totalmente incorrectas, pero sí mejorables. Estos  resultados se interpretarán como NO CONCLUYENTES.

Hay  que hacer notar que el criterio interpretativo aquí expuesto, que  se  resume en  la  Tabla  4, será válido en la interpretación de resultados obtenidos  en  las  mismas condiciones en las que se ha realizado la presente experimentación:

1. el mismo número de inoculaciones y en los mismos puntos.
2. exclusión en el cálculo de x* el valor más alejado del promedio.
3. realización de las mismas prácticas de limpieza, utilizando las mismas técnicas, productos y dosis.

El  criterio deducido es válido para la interpretación de los  resultados  promedio de  un análisis, x*. Para la interpretación de los resultados de los puntos  individuales, operando  de  un modo similar se llega al criterio interpretativo recogido en la  Tabla  4 (se  opera con la media aritmética de todos los puntos, eliminando el más alejado  de  la media: 79 valores).

El  criterio  interpretativo aquí calculado, para la evaluación de las  prácticas  de limpieza , tiene la importante característica de ser un criterio  «realista», ya que parte de resultados obtenidos experimentalmente, es decir, se trata de un criterio «que  se puede conseguir» si se aplican correctamente las prácticas de limpieza. Esto evita interpretaciones subjetivas a la hora de aplicar esta técnica analítica.

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Conclusiones

La  evaluación del nivel de limpieza de superficies, mediante la  aplicación  de  la  técnica de bioluminiscencia, mediante determinación de ATP, y la  interpretación  de  resultados  siguiendo  los  criterios aquí deducidos, demuestra tener un alto grado  de  fiabilidad,  ya que se obtienen resultados muy repetitivos.

El uso de protocolos adecuados para la realización de las operaciones de  limpieza y desinfección en industrias y establecimientos alimentarios, y el control  sistemático de  estas  operaciones  mediante  técnicas analíticas como  la  descrita  en  este  trabajo, tienen  una gran importancia en la calidad de los productos alimenticios, en  el  alargamiento  de la vida comercial y en la prevención de toxiinfecciones (se ha  evaluado  que en cerca de un 30 % de los brotes declarados de toxiinfecciones con origen alimentario, uno de los factores responsables es la contaminación del equipamiento).

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TABLA  1: Resultados  de las series de análisis de Bioluminiscencia  (LRU./100 cm²).  (Se señalan en negrita los valores más alejados de la media de cada serie).

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TABLA 2: Valores de las medias corregidas x*_i (expresados en LRU./100 cm²)

X^* = promedio del conjunto de valores x*_i ; s = desviación típica del conjunto de valores x*_i

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TABLA 3: Especificaciones para el análisis de superficies (valores promedio, x*).

(Resultados expresados en LRU/100 cm²)

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TABLA 4: Especificaciones para el análisis de superficies (valores individuales, x).

(Resultados expresados en LRU./cm²)

BIBLIOGRAFÍA

1. Orihuel Iranzo, E. J.; Bertó Navarro, R. y Canet Gascó, J.J. “Monitorización de la Limpieza y Desinfección en Industrias Alimentarias”. Alimentación, Equipos Y Tecnología, Septiembre, (1998).
2. BIOSER. Sistemas de Monitorización de Higiene.
3. Betelgeux, S.L., Departamento Técnico. “IT-QUACIDE MC7-15-013”. (2013).
4. Betelgeux, S.L., Departamento Técnico. “IT-BETELENE FORTE-16-009”. (2016).
5. Larson, .E. L., Aiello, A. E., Gomez-Duarte, C., X. Lin, S, Lee, L., Della-Latta, P., Lindhardt, C. “Bioluminescence ATP monitoring as a surrogate marker for microbial load on hands and surfaces in the home”. Food Microbiology 20 (2003) 735–739.
6. Osimani, Andrea et al. “Bioluminescence ATP Monitoring for the Routine Assessment of Food Contact Surface Cleanliness in a University Canteen.” Ed. Paul B. Tchounwou. International Journal of Environmental Research and Public Health 11.10 (2014): 10824–10837. PMC. Web. 14 June 2016.
7. Luminómetro 3M™ Clean‑Trace™ NGi. Manual de usuario. http://multimedia.3m.com/mws/media/921114O/3m-clean-trace-ngi-luminometer-user-manual-spanish.pdf;
8. Reglamento (CE) nº 852/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo de 29 de abril de 2004 relativo a la higiene de los productos alimenticios.