Bacteriófagos para el control de biofilms en la industria alimentaria

Las prácticas de higiene en la industria alimentaria tienen como objetivo final la eliminación de microorganismos indeseados de las superficies de trabajo, ya que estos pueden afectar negativamente a la calidad o seguridad de los alimentos producidos. Habitualmente, la mayoría de bacterias se encuentran organizadas en comunidades multiespecies adheridas a las superficies en forma de biofilms. Como se ha explicado anteriormente, la formación de biofilms es un mecanismo de supervivencia bacteriano que confiere numerosas ventajas frente a las bacterias en estado libre (planctónicas). La matriz extracelular que rodea a las bacterias en un biofilm está compuesta por una mezcla de compuestos poliméricos como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Esta estructura mantiene a las bacterias próximas entre sí y permite la conservación y distribución de agua, nutrientes, oxígeno, enzimas y restos celulares. Adicionalmente, la matriz del biofilm protege a las bacterias de condiciones medioambientales adversas y de los procesos de limpieza y desinfección [1]. Por estas razones, los biofilms actúan como reservorios de microorganismos, potencialmente alterantes o patógenos, y su presencia supone un riesgo para la seguridad alimentaria.

La eliminación de los biofilms de los entornos de producción alimentaria precisa de un enfoque distinto a los procedimientos de higiene rutinarios. Por un lado, es necesario emplear productos que actúen de forma eficaz frente al biofilm, degradando la matriz del biofilm para permitir que las sustancias activas biocidas lleguen en la concentración adecuada a las bacterias presentes [2]. Por otro lado, la presencia de biofilms implica también deficiencias en el proceso de higiene, que es necesario revisar para identificar puntos críticos en los que la higiene no se realiza de forma adecuada e implementar las medidas necesarias para su corrección [3].

Actualmente se están investigando nuevos enfoques para minimizar la presencia de biofilms en la industria alimentaria. Adicionalmente a las estrategias basadas en el tratamiento físico o químico de los biofilms, otras estrategias de eliminación de biofilms se basan en la inhibición de las señales de quorum sensing, la inducción de la separación del biofilm de la superficie, el bloqueo de las señales reguladoras del biofilm o el tratamiento de superficies para evitar la adhesión de biofilms [4]. Una de las líneas de trabajo más prometedoras para el control de biofilms en la industria es el empleo de bacteriófagos. Los bacteriófagos, comúnmente denominados fagos, son virus que infectan de forma específica bacterias de una especie o género determinados. Como se explicó en un artículo anterior, los fagos son ubicuos en la naturaleza y se comenzaron a aplicar de forma terapéutica a principios del siglo XX, principalmente en países de la extinta Unión Soviética y de Europa del Este. El mecanismo de acción de los fagos consiste en una secuencia de 5 pasos [5]:

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1. Adsorción del fago sobre la superficie de la célula bacteriana
2. Inyección de material genético del fago al interior de la bacteria
3. Replicación del ADN vírico en el interior de la bacteria
4. Formación de nuevos fagos en el interior de la bacteria
5. Lisis celular por aumento de la presión interior y liberación de los nuevos fagos

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Figura 1. Ciclo lítico de los fagos en el interior de un biofilm. Extraído de [5] (Creative Commons Attribution License).

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En el caso de bacterias alojadas en un biofilm, la presencia de la matriz extracelular supone una importante barrera física para el acceso del fago a las células bacterianas. Algunos fagos son capaces de solventar este problema mediante el uso de enzimas específicas que degradan polisacáridos de la matriz del biofilm [6]. Estas enzimas suelen estar alojadas en la cola del fago y facilitan la penetración del fago al interior del biofilm. Adicionalmente, muchos fagos poseen proteínas que facilitan la disrupción de la membrana celular, llamadas endolisinas, que facilitan la inyección del material genético del fago al citoplasma celular. Las endolisinas poseen así actividad antimicrobiana, especialmente en el caso de bacterias Gram positivas [7].

Existen diversos factores que contribuyen a considerar el uso de fagos para el control de biofilms como una alternativa viable a los procedimientos convencionales. Entre estos factores, se encuentra la limitada eficacia de los desinfectantes convencionales frente a biofilms, debido a la limitada capacidad de difusión de las sustancias activas biocidas en la matriz extracelular. Esto puede dar lugar a la aparición de cepas resistentes a los biocidas empleados, por exposición de las bacterias a concentraciones subletales del biocida. Por otro lado, la aplicación de fagos supone un tratamiento altamente selectivo, ya que afecta únicamente a las bacterias huésped del fago, sin riesgos para los operarios o, incluso, para los alimentos.

En los últimos años se han realizado numerosos estudios relativos a la actividad antibacteriana de fagos frente a biofilms de patógenos alimentarios como Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli O157:H7, Salmonella Typhimurium o Campylobacter jejuni [5]. En general, estos estudios confirman la efectividad de los fagos para la eliminación de biofilms formados en laboratorio en condiciones y sustratos comparables a los encontrados en la industria alimentaria. Así, por ejemplo, el fago P100, presente en el producto Phageguard Listex (Micreos, Holanda) consiguió reducciones de entre 3,5 y 5,4 log UFC/cm² en los recuentos de L. monocytogenes en biofilms crecidos en distintas condiciones. El uso de endolisinas para la eliminación de biofilms también ha sido ampliamente estudiado en los últimos años, con resultados comparables a los obtenidos en el caso de los fagos. En estos estudios, se ha encontrado que, adicionalmente a la disminución de células viables de las bacterias diana, se produjo también disgregación y degradación de la matriz extracelular.

En la mayoría de casos, la inactivación de bacterias o eliminación de matriz extracelular no fueron completas, lo que indica la necesidad de combinar este tipo de tratamientos con otros tratamientos de higiene específicos para la eliminación de biofilms. Generalmente, los valores esperados de reducción microbiana mediante el uso de fagos oscilan entre 1 y 3 log UFC/cm², empleando concentraciones de fagos entre 10⁸ y 10⁹ UFP/mL. La principal limitación para conseguir reducciones mayores se encuentra en la ausencia de movilidad de los fagos, de manera que se requieren elevadas concentraciones tanto de fago como de bacteria huésped para que se pueda producir el encuentro con una cierta probabilidad. Otro aspecto importante a la hora de considerar el uso de fagos como alternativa para la eliminación de biofilms es el hecho de que la elevada especificidad de los fagos resulta en la inactivación selectiva de las bacterias huésped, dejando al resto inalteradas. Esto, que puede ser una ventaja en casos en los que interesa mantener la flora microbiana residente (por ejemplo en industrias lácteas), se convierte en una limitación para uso como alternativa a desinfectantes de amplio espectro.

Así, el uso de fagos para eliminación de biofilms debe considerarse como un complemento a las operaciones de higiene y a los tratamientos antibiofilm. Esta solución es especialmente efectiva en el caso de contaminación por cepas persistentes o en los casos en los que se han identificado puntos negros que actúan como reservorios de un patógeno específico. Por otro lado, la seguridad y ausencia de efectos sobre los alimentos de los fagos hacen que estos se puedan aplicar directamente sobre alimentos o en animal vivo para controlar el crecimiento de patógenos. En Estados Unidos, la FDA ha autorizado el uso de distintos productos basados en fagos en entornos de producción alimentaria, tanto como conservantes en alimento como en tratamiento de superficies. Otros países como Australia permiten también esta aplicación. En Europa, La EFSA ha emitido diversas opiniones favorables al uso de fagos en alimentos, pero no existe aún un Reglamento Europeo que autorice su aplicación. Sin embargo, en distintos países europeos existen autorizaciones y exenciones al uso de fagos como coadyuvantes alimentarios, así que esta situación puede cambiar en el futuro. En cuanto al uso de fagos para el tratamiento de superficies, no existe una restricción específica a esta aplicación cuando se evite el contacto con los alimentos, de manera que es una opción viable como complemento a los procesos de higiene convencionales.

Bibliografía

[1] H.-C. Flemming and J. Wingender, “The biofilm matrix.,” Nat. Rev. Microbiol., vol. 8, no. 9, pp. 623–33, Sep. 2010.

[2] F. Lorenzo, E. Orihuel, R. Bertó, and C. López, “Control de la presencia de biofilms en las industrias alimentarias,” Aliment. Equipos y Tecnol., vol. 264, pp. 43–47, 2011.

[3] E. Orihuel, R. Bertó, J. J. Canet, and F. Lorenzo, “El control de Listeria monocytogenes persistente en industrias alimentarias (I),” Aliment. Equipos y Tecnol., pp. 16–21, 2012.

[4] S. Y.-E. Tan, S. C. Chew, S. Y.-Y. Tan, M. Givskov, and L. Yang, “Emerging frontiers in detection and control of bacterial biofilms.,” Curr. Opin. Biotechnol., vol. 26, pp. 1–6, 2014.

[5] D. Gutiérrez, L. Rodríguez-Rubio, B. Martínez, A. Rodríguez, and P. García, “Bacteriophages as weapons against bacterial biofilms in the food industry,” Front. Microbiol., vol. 7, no. JUN, pp. 1–15, 2016.

[6] D. P. Pires, H. Oliveira, L. D. R. Melo, S. Sillankorva, and J. Azeredo, “Bacteriophage-encoded depolymerases: their diversity and biotechnological applications,” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 100, no. 5, pp. 2141–2151, 2016.

[7] V. A. Fischetti, “Bacteriophage lysins as effective antibacterials,” Curr. Opin. Microbiol., vol. 11, no. 5, pp. 393–400, 2008.